2020年11月19日，Genome Research在線發(fā)表了中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所中科院計算生物學重點實驗室（馬普伙伴計算生物學研究所）邵振研究組的方法學論文“MAnorm2 for quantitatively comparing groups of ChIP-seq samples”，報道了其開發(fā)的新一代MAnorm2計算模型。該模型能夠?qū)Χ鄻颖綜hIP/ATAC-seq數(shù)據(jù)按照特定標簽分組進行統(tǒng)計建模和組間定量比較，可靠地在樣本組層面鑒定組間顯著差異的ChIP/ATAC-seq信號。
染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）實驗被廣泛用于刻畫轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和組蛋白修飾的全基因組分布。比較來自不同細胞類型的ChIP-seq樣本是刻畫細胞分化和病變過程中動態(tài)轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控的關(guān)鍵基礎(chǔ)。2012年，邵振與張一婧等合作在Genome Biology發(fā)表了用于兩個ChIP-seq樣本之間進行一對一定量比較的MAnorm模型。近年來，隨著實驗技術(shù)的發(fā)展和測序成本的不斷降低，在ChIP-seq樣本組（而非單個樣本）之間進行比較分析已成為越來越常見的研究需求。一方面，研究者會產(chǎn)生同一實驗的多個生物學重復來提高實驗結(jié)果的可信度。另一方面，通過將來自不同個體的樣本根據(jù)特定標簽（如年齡、性別、患病與否、疾病亞型等）分組進行比較，研究者能夠控制個體差異造成的影響，更可靠地識別與該標簽關(guān)聯(lián)的差異結(jié)合位點。然而，由于ChIP-seq實驗固有的高復雜度和高噪聲水平，以及不同比較場景所特有的技術(shù)困難，現(xiàn)階段對多樣本ChIP-seq數(shù)據(jù)進行分組定量比較仍然是一個巨大的計算方法學挑戰(zhàn)。
在ChIP-seq數(shù)據(jù)標準化這一步，MAnorm2沿用了MAnorm的核心假設(shè)，通過重構(gòu)其信號強度變換體系，新發(fā)展了以參照樣本為基準的多樣本并行ChIP-seq信號標準化流程。進一步，針對多樣本分組比較的需求，MAnorm2搭建了一個理論上適應(yīng)任意樹狀分組結(jié)構(gòu)的層級化多樣本標準化策略。在完成標準化后，MAnorm2接下來針對每個基因組區(qū)域上觀察到的ChIP-seq信號組間差異進行統(tǒng)計檢驗。在通常組內(nèi)樣本數(shù)較少的局限下（2-3個重復本），為了能更準確地衡量每一個基因組區(qū)域上的組內(nèi)樣本間ChIP-seq信號變化水平（within-group variability），MAnorm2設(shè)計了一個經(jīng)驗貝葉斯框架，利用擬合均值-方差曲線來給單個區(qū)域的組內(nèi)變化水平賦予一個先驗分布，并進一步通過平衡先驗和后驗觀測來更準確地估計ChIP-seq信號的組內(nèi)變化水平，從而提高對組間差異ChIP-seq信號的靈敏度（圖一）。
圖一：（A）在不同基因組區(qū)域間擬合均值-方差曲線（mean-variance curve；MVC）。（B）根據(jù)不同的統(tǒng)計指標對基因啟動子按照差異H3K4me3 ChIP-seq信號的可能性進行排序，并計算其中差異表達基因（differentially expressed genes；DEGs）啟動子所占的比例。（C）檢查不同類型的基因啟動子上差異H3K4me3的統(tǒng)計顯著性。虛線對應(yīng)P值為0.05。
與已有的其他經(jīng)驗貝葉斯方法相比，MAnorm2最大的優(yōu)勢在于考慮了不同樣本組的組內(nèi)ChIP-seq信號變化水平可能存在系統(tǒng)性差別。這一情形在正常人和癌癥患者之間的比較中經(jīng)常出現(xiàn)：由于腫瘤組織或血液樣本本身的異質(zhì)性以及癌癥亞類型和不同患病階段的多樣性，癌癥樣本組的組內(nèi)信號變化水平往往顯著高于正常樣本組。為了解決這個問題，MAnorm2通過在建模過程中引入一個方差比率因子，首先把不同樣本組的全局組內(nèi)信號變化水平修正至一致，然后使用修正后的方差進行均值-方差曲線的擬合和參數(shù)估計（圖二）。研究人員將MAnorm2與現(xiàn)有的其他ChIP-seq差異分析工具進行了系統(tǒng)地比較，發(fā)現(xiàn)MAnorm2展現(xiàn)了明顯更優(yōu)越的使用性能，尤其是當進行比較的樣本組擁有明顯不同的組內(nèi)變化水平時，例如癌癥和正常樣本相比較。
圖二：（A）對來自不同的人的H3K27ac ChIP-seq樣本進行主成分分析。這里LCL（lymphoblastoid cell line）組包含三個源于正常人的B細胞的細胞系；CLL（chronic lymphocytic leukemia）組包含三個源于慢性淋巴細胞白血病患者的B細胞的細胞系。（B）關(guān)于來自不同組的均值和未修正的方差的散點圖。（C）關(guān)于均值和修正后的方差的散點圖，以及由此進行下一步統(tǒng)計建模。
此外，該模型的應(yīng)用場景和統(tǒng)計模型具有良好的可擴展性。在正文中，研究人員不僅展示了MAnorm2在ATAC-seq數(shù)據(jù)差異分析上同樣適用，還將其統(tǒng)計模型擴展到可以同時比較任意多個樣本組，并發(fā)現(xiàn)其使用效果優(yōu)于傳統(tǒng)的ANOVA方法。
該研究由中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所等多家機構(gòu)合作完成。中科院營養(yǎng)健康所博士后涂世奇為該論文第一作者，邵振研究員為通訊作者。中科院植物生理生態(tài)研究所張一婧研究員、美國西南醫(yī)學中心徐劍教授和波士頓大學的David J. Waxman教授對該研究工作的提出和完善也做出了重要貢獻。該研究獲得了國家自然科學基金委（31871280 和31701140）、科技部、中科院等機構(gòu)的資助。
論文鏈接：https://genome.cshlp.org/content/early/2020/11/18/gr.262675.120
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