2019年2月28日，Science（《科學(xué)》）發(fā)表了一篇名為“Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos”（《單堿基編輯會導(dǎo)致難以預(yù)測的脫靶性單核苷酸突變》）的研究論文，該研究由中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所（簡稱神經(jīng)所）、中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心和中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所隸屬的計算生物學(xué)研究所（中國科學(xué)院-馬普學(xué)會計算生物學(xué)伙伴研究所，簡稱計算生物學(xué)所）、斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)系以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所合作完成。該研究建立了一種被命名為GOTI的新型脫靶檢測技術(shù)，并使用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)新興的單堿基編輯技術(shù)有可能導(dǎo)致無法預(yù)測的脫靶，因而存在風(fēng)險。此研究顯著提高基因編輯技術(shù)的脫靶檢測敏感性，并且不借助于任何脫靶位點(diǎn)預(yù)測技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)之前的脫靶檢測手段無法發(fā)現(xiàn)的完全隨機(jī)的脫靶位點(diǎn)，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)。
作為新一代基因編輯工具，CRISPR/Cas9自從2012年被發(fā)明以來，一直以其高效性和特異性備受世人的期待和廣泛關(guān)注，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術(shù)將為人類的健康做出巨大貢獻(xiàn)。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問世以來，其脫靶風(fēng)險也一直備受關(guān)注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話，脫靶效應(yīng)可能會引起包括癌癥在內(nèi)的很多種副作用，因此一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術(shù)，將會成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關(guān)鍵。
在此之前，人們推出過多種檢測脫靶的方案，然而之前的技術(shù)大多都依賴于未必十分準(zhǔn)確的脫靶位點(diǎn)預(yù)測，并且會引入大量噪音的體外擴(kuò)增，這導(dǎo)致人們一方面難以顧及預(yù)測位點(diǎn)以外的脫靶情況，另一方面又很難將脫靶信號從背景噪音中分離出來，因此關(guān)于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實(shí)脫靶率一直存在爭議。人們希望可以找到一種既能夠不依賴于脫靶位點(diǎn)預(yù)測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。
為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，李亦學(xué)研究組與合作者建立了一種名叫GOTI的脫靶檢測技術(shù)。在小鼠受精卵分裂到二細(xì)胞期的時候，編輯一個卵裂球，并使用紅色熒光蛋白標(biāo)記。在小鼠胚胎發(fā)育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細(xì)胞和沒有基因編輯細(xì)胞，全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細(xì)胞體外擴(kuò)增帶來的噪音問題。由于實(shí)驗(yàn)組和對照組來自同一只小鼠，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細(xì)胞的基因組，其中的差異基本就可以認(rèn)為是基因編輯工具造成的。
在與合作單位的共同努力下，GOTI系統(tǒng)被成功建立了起來。借助于這個系統(tǒng)，團(tuán)隊成員先是檢測了最經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，設(shè)計良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應(yīng)，這個結(jié)果結(jié)束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團(tuán)隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術(shù)BE3，這個系統(tǒng)可以精確引入點(diǎn)突變，在之前的研究中從未發(fā)現(xiàn)過有明顯的脫靶問題。然而在GOTI的檢測下發(fā)現(xiàn)，BE3存在非常嚴(yán)重的脫靶，這些脫靶由于大多出現(xiàn)在傳統(tǒng)脫靶預(yù)測認(rèn)為不太可能出現(xiàn)脫靶的位點(diǎn)，之前一直沒有發(fā)現(xiàn)其脫靶的嚴(yán)重問題。團(tuán)隊分析后認(rèn)為，這些脫靶位點(diǎn)有部分出現(xiàn)在抑癌基因上，因此經(jīng)典版本的BE3有著很大的隱患，不適合作為臨床技術(shù)。
在基于GOTI技術(shù)的脫靶檢測中，團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)以BE3為代表的部分基因編輯技術(shù)存在無法預(yù)測的脫靶風(fēng)險，讓世人重新審視了這些新興技術(shù)的風(fēng)險。更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準(zhǔn)確性上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越之前的基因編輯脫靶檢測技術(shù)，達(dá)到了目前理論和技術(shù)水平所能達(dá)到的最高程度，有望由此建立新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
該項工作主要由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心/神經(jīng)科學(xué)研究所博士后左二偉、中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/生化與細(xì)胞所博士研究生孫怡迪、計算生物學(xué)所研究員魏武、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所助理研究員袁堂龍等在神經(jīng)所楊輝研究員、計算生物學(xué)所李亦學(xué)研究員、斯坦福大學(xué)Lars M. Steinmetz教授的指導(dǎo)下完成，并得到了神經(jīng)所流式分選平臺的的大力協(xié)助，是眾多研究組通力合作的重要成果。本工作得到國家高科技研發(fā)項目（2018YFC2000100與2017YFC1001302 to Yang Hui, 2017YFC0908405 to WW），中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（XDB32060000），國家自然科學(xué)基金委員會（31871502, 31522037），上海市科技重大項目（2018SHZDZX05），上海市科學(xué)技術(shù)委員會項目（18411953700, 18JC1410100），美國國立衛(wèi)生研究院P01項目（P01HG00020527）等項目的資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1126/science.aav9973
(A)實(shí)驗(yàn)流程?(B)脫靶位點(diǎn)數(shù)目比較。Cre-, Cas9-, BE3- and ABE7.10組分別有14+/-12 (SEM, n=2),?12+/-4 (SEM, n=11),?283+/-32 (SEM, n=6)和10 +/- 5 (SEM, n = 4)個SNVs?(C)突變類型的分布比較。每個格子中的數(shù)字表示該種突變類型占全部突變的比例 (D)脫靶SNVs富集在基因組中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域?(E)Genes包含脫靶位點(diǎn)的基因在細(xì)胞胚胎中有更高的表達(dá)量。
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